如何防止引物相互作用？
最近在研究基于RNA的基因表达谱，遇到一个问题：在构建cDNA文库时，总是有一些基因转录本没有被插入到载体中；同时，利用mRNA进行反转录时，也有部分基因的RT-PCR产物不能被扩增（如图1）。 图1 用不同引物对同一份样品进行逆转录和聚合酶链反应（PCR） 通过比较分析发现，无法被扩增的序列片段长度大约都是250bp，并且发现有重叠区域（图2）。这些片段可能是由于引物二聚体或三聚体形成所造成的。为了验证这一猜想，我们加入了EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)，一种能够与钙、镁离子结合的阴离子表面活性剂，抑制了引物二聚体的形成。果真见到了目的基因的特异性条带（图3）。由此可以证明我们的猜想——引物二聚体或者三聚体形成了假阳性，导致了部分基因的表达结果未能检出。
图2 包含有重叠区域的两段序列 图3 以EDTA存在下进行逆转录和PCR的结果 那么，为什么在实验的过程中会出现引物二聚体呢？我们仔细分析了实验过程，发现在RNA的提取过程中，如果RNA溶液浓度太低，就可能使引物彼此相遇并发生相互作用。而在后续步骤中，无论是否添加Mg²⁺，只要Taq DNA聚合酶持续作用，引物二聚体就会不断地被加合。因此我们可以推测，当RNA溶液的浓度低时，尽管其体积足以完成后续的逆转录和PCR反应，但加入的Mg²⁺可能不足以激活所有的引物，从而造成了引物的自激发。 为了防止这种情况的出现，我们在实验的过程中调整了RNA溶液的浓度。经过改进后，之后的所有试剂浓度都以对数形式增加，保证了各步反应的充分进行。